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    細胞侵襲實驗全步驟解析

    發布時間: 2022-06-08  點擊次數: 2252次


    實驗材料準備:


    細胞,可拍照的顯微鏡,Transwell小室,孔徑8μm,沒包被膠的Transwell,遷移實驗的細胞培養板24孔板。細胞培養板應當與購買的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,無血清的基礎培養基,BSA,正常的*培養基,無菌PBS,棉簽,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,結晶紫染液(0.1%PBS結晶紫)


    Transwell操作步驟


    01

    用BD公司的Matrigel 1:8或者根據細胞產生mmp的量來決定稀釋,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進行基底膜水化。


    02

    制備細胞懸液前可先用基礎培養基加1%的血清培養細胞,讓細胞饑餓12-24h,進一步去除血清的影響。


    03

    消化細胞,終止消化后離心棄去培養液,(用PBS洗1-2遍),用含0.1%的BSA的無血清培養基重懸及調整密度,通常調整細胞密度至5×10^5cells/ml。


    04

    取細胞懸液100μl加入Transwell上室, 也可以根據細胞生長速度進行調整,操作小提示:接種劑量不同的細胞,其侵襲能力是不同的,細胞量過多,穿過膜的細胞會過多過快,最后會難以統計結果;而細胞量過少,可能還沒到檢測的時間點,所有的細胞都已穿過,進入下室。因此最少也要保證在收樣的時候,上室內還要有一定量的細胞存在。


    05

    24孔板下室一般加入600μl含生長因子或血清的*培養基,特別注意的是,下層培養液和小室間常會有氣泡產生,一旦產生氣泡,下層培養液的趨化作用就會減弱甚至消失,種板時一旦出現氣泡,要將小室提起去除完氣泡,再將小室放進培養板。若是平行孔,一般設置兩組.


    06

    培養細胞:常規培養12-48h(主要依細胞侵襲能力而定)。24h較常見,時間節點的設置除了要考慮到細胞的侵襲力外,處理因素以及細胞數目的影響也不可忽視。




    統計結果步驟:


    01

    采用直接計數法,取出Transwell小室,棄去孔中培養液,用無鈣的PBS洗2遍,甲醇固定30分鐘,將小室適當風干。


    02

     0.1%結晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞,注意不要蹭到已穿膜的那一層細胞,之后再用PBS洗3遍。


    03

    400倍顯微鏡下每個樣本取6-10個視野觀察細胞計數,取平均值,統計分析。


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