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    怎么使用GSIS方法檢測細胞胰島素分泌

    發布時間: 2023-01-04  點擊次數: 767次

    Min6細胞是這次贈送活動中很多客戶選擇的細胞,一共送出去有50多株,隨之而來的就是問胰島素的檢測,很多客戶檢測出來只有低表達。


    Min6細胞培養需要注意三點:

    1.細胞易聚團,消化的時間表面上看會非常短暫,大約30秒會全部脫落,脫落后請延長消化時間到2分鐘后,再中和,細胞后期聚團會減少。

    2.活細胞運輸的時候會漂浮,請收集培養基離心,離心后重新鋪板以完-全培養基剛沒過細胞為準,完-全培養基加太多會導致細胞浮力過大,貼壁不上。

    3.培養基請一定要加0.05mm的β-Mer


    以下是我們檢測使用的buffer和protocol,步驟不能少,一步一步的來。


    Buffer的配制:

    NaCl 114mM, KCl 4.7mM, KH2PO4 1.2mM, MgSO4-7H2O 1.16mM, NaHCO3 25.5mM, CaCl2 2.5mM, HEPES 20mM, 0.2% BSA --> pH 7.2-7.5(一定要控制PH值范圍)


    操作步驟:以2mM glucose 和25mM glucose 為例:

    細胞鋪板每孔大約2000個細胞,鋪板前三天左右脫抗生素采用滅活血清+β-Mer培養1640+10%FBS(滅活)+0.05mm β-Mer;在96孔板中培養24小時,然后將培養基改為含2mM葡萄糖培養基過夜。

    1.去除培養基,1 x PBS清洗細胞5分鐘

    2.基礎緩沖液(2mM 葡萄糖) ,2小時孵育 -- > 培養

    3.去除上清液 -- > 1 x pbs 清洗,請注意不要觸碰底面

    4.葡萄糖刺激(2mM ) ,1小時孵育

    5.收獲上清液 -- > 1 x pbs 清洗,請注意不要觸碰底面

    6.葡萄糖刺激(2mM ) ,1小時孵育;

    7.收獲上清液 -- > 1 x pbs 清洗,請注意不要觸碰底面

    8.上清液取樣 -- > 1500轉,5 min,4度;

    9.細胞裂解---- > 蛋白質定量---- > 上機


    以下為檢測結果:

    注意點:

    為了確保細胞分泌的胰島素混合到上清液樣本中,可以在培養期間在100-300轉的平板振蕩器上輕輕攪動細胞。


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