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    免疫熒光抗體法

    發布時間: 2023-01-05  點擊次數: 564次

    原理

    用人結腸癌細胞為免疫原,免疫小鼠,制得鼠抗人結腸癌細胞表面抗原(Ag)的單克隆抗體 IgG(第一抗體),二者可以發生特異性的抗原抗體反應,形成抗原抗體復合物,再加入市售(也可自制)的熒光標記的羊抗鼠IgG抗體(第二抗體),可以與復合物進一步發生抗原抗體反應(二次抗體反應),這樣就可以在光顯微鏡下觀察到這種抗原在結腸癌細胞表面的存在。

    材料與儀器

    HeLa細胞
    1640培養液 小牛血清 甲醛固定液 PBS 液體石蠟
    蓋片 載片 培養瓶 培養皿 濾紙 鑷子 吸管 倒置顯微鏡 熒光顯微鏡 微量加樣器

    步驟

    1.  將培養瓶中的結腸癌細胞接種到裝有蓋片的培養皿中,培養2~3天。

    2.  在倒置鏡下觀察到蓋片上的細胞生長狀態良好后,在蓋片左上角用玻璃筆做一下標記,以免在以后的操作中正反面顛倒。

    3.  將蓋片放在甲醛固定液中,4℃固定5~10分鐘。

    4.  用PBS洗三次,注意不要將PBS液直接倒在蓋片的細胞面,以免引起細胞大量丟失。用濾紙片將蓋片上的PBS輕輕吸干,不要損傷細胞層。

    5.  將已稀釋好的小鼠抗體滴在蓋片上.每個蓋片50 ul,37℃溫育30分鐘。

    6.  用PBS洗三次,濾紙吸干。

    7.  將已稀釋好的熒光標記羊抗鼠二次抗體5ul滴加在蓋片上,37℃溫育30分鐘。

    8.  用PBS洗三次,濾紙吸干。

    9.  將載片上滴一滴液體石蠟。然后將蓋片細胞面朝下放到載玻片上,在熒光顯微鏡下觀察。


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