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    細胞凍存實驗

    發布時間: 2023-01-05  點擊次數: 870次

    原理

    傳統上的細胞凍存(甘油/二甲基亞砜做保護劑)講求的是:慢凍速溶。細胞凍存時向培養基中加入的甘油或二甲基亞砜(DMSO),這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外,減少細胞內冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。

     

    用途

    細胞保種

    材料與儀器

    【實驗材料】細胞、DMSO、0.25% Trypsin-EDTA(或細胞刮刀)、100 X雙抗、PBS、胎牛血清、DMEM 完-全培養基、75% 乙醇、胰酶、異丙醇;

    【儀器與用品】凍存管、37度恒溫水浴鍋、培養皿(6 cm)、細胞凍存盒(已添加異丙醇)或凍存泡沫盒、記號筆、-80度冰箱、倒置相差顯微鏡、凍存管、37度恒溫水浴鍋、培養皿(6cm)、液氮罐、離心機、細胞房專用超凈臺、移液槍及移液槍頭(無菌或滅菌后烘干)、一次性細胞計數板、細胞自動計數儀、培養箱、移液管。

    步驟

     1.  預先配制凍存液:按正常培養基:DMSO =9:1比列配制凍存液;

    2.  取對數生長期細胞,用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來,離心1000 rpm,5 min;

    3.  去除胰蛋白酶及舊的培養液,加入適量配制好的凍存培養液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數,調節凍存液中細胞的最終密度為5×106/mL~1×107/mL;

    4.  將細胞分裝入凍存管中,每管1~1.5 ml;

    5.  在凍存管上標明細胞的名稱,凍存時間、細胞代數及操作者;

    6.     往凍存盒中加入異丙醇(在負八十冰箱中能以1℃/min的速度下降)放入負八十冰箱即可,建議12小時以上,一般可在負八十中保存半年至一年,長期保存要轉移至液氮中;商用凍存液可以直接凍存管放負八十冰箱。

     

    注意事項

    1、液氮凍存不建議用國產凍存管,復蘇時容易爆管;

    2、消化細胞時,不能過度消化;

    3、DMSO溶于DMEM培養基會放熱,應提前5-10分鐘配置凍存液。用凍存盒時避免異丙醇將標記擦掉;

    4、二甲基亞砜能穿透許多合成的或天然的膜,包括皮膚和橡膠手套。因此,應謹慎處理。將凍存管放入液氮時,必須使用保護性手套和面罩。

    常見問題

    1、細胞消化過度,導致復蘇時細胞狀態不好;

    2、負八十冰箱中長期保存細胞效果不好,應及時將細胞轉移至液氮中;

    3、國產凍存管在液氮中容易漏液氮,導致復蘇時曝管,所以放液氮中盡量使用質量較好的凍存管。


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