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    混合淋巴細胞增殖

    發布時間: 2023-01-11  點擊次數: 521次

    簡介

    混合淋巴細胞增殖實驗也稱混合淋巴細胞培養(MLC)或稱混合淋巴細胞反應(MLR),常用于器-官-移-植前的組織配型,以測定受體和供體主要組織相容性抗原(HLA 抗原)相容的程度。

    材料與儀器

    器材:細胞培養瓶、培養板、吸管等、CO2 細胞培養箱、超凈臺。
    試劑:
    ① 10%FCS-RPMI 1640 培養基 ;
    ② 細胞 DCs 細胞、反應細胞、外周血單個核細胞。
    ③ 3 H-TdR 工作液


    步驟

    混合淋巴細胞增殖實驗的基本過程可分為如下幾步:
    (一)刺激細胞(DCs)的制備
    A. 取健康志愿者肝素抗凝的外周血,淋巴細胞分離液分離單個核細胞
    B. 以 10% FCS-RPMI 1640 懸浮細胞置培養瓶中,37℃、5% CO2 培養 2 小時,輕輕翻過培養瓶,棄掉培養上清,將非貼壁細胞棄掉,即得貼壁的單核細胞
    C. 補加 10% FCS-RPMI 1640 同時加入 20 ng/ml 的 hGM-CSF,500 IU/ml 的 IL-4,培養至第 7 天,收集懸浮細胞,即為 DCs
    D. 刺激細胞經 25 μg/ml 的絲-裂-霉-素 C 或 2000 rad y-射線照射處理使刺激細胞失去增殖能力。
    (二)反應細胞的制備
    A 取健康人外周血制備單核細胞,PBS 洗 3 次后,37℃、5% CO2 貼壁 2 小時,收集懸浮細胞,作為反應細胞
    B 以 RPMI 1640 培養液重懸,調整細胞濃度至 1x106 個/ml。
    (三)混合淋巴細胞反應
    A 將刺激細胞調整濃度分別為 1x106、5x105、2x10、1x105、5x104 個/ml, 10%FCS-RPMI 1640 培養于 96 孔培養板中,每濃度設立 3 孔,100μL/孔
    B 將反應細胞濃度按 1x106 個/ml 每孔分別加入上述各孔中,100μl/孔
    C 同時設立刺激細胞對照組(不同濃度刺激細胞 100μl+培養液 100μl)和反應細胞對照組(反應細胞 100μl+培養液 100μl)
    D 37℃,5% CO2 培養 5 天后,3 H-TdR 摻入率檢測反應細胞的增殖水平。


    注意事項

    1. 實驗中注意無菌操作
    2. 如作單向混合淋巴細胞實驗,則刺激細胞接受照射劑量要準確,使細胞暫時存活,但失去增殖的能力。


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