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    免疫細胞轉染后細胞毒性較高是為何?

    發布時間: 2023-01-05  點擊次數: 1144次
       免疫細胞轉染時先吸去培養皿中的培養基,用PBS或者無血清培養基清洗?次。更換無血清培養基。準備轉染制備液,?滅菌后的EP管制備。以六孔板為例,A液-200μl Opti-MEM稀釋4μg質粒;B液-200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000,分別將A液、B液輕輕混勻,靜置5min,吸取B液加至A液中,輕輕混勻,室溫靜置20min。
      加?轉染試劑到每個孔的培養基中,6h后,更換成全培養基,繼續培養到24-48小時。
      免疫細胞轉染在轉染24h后需要觀察轉染過程對細胞毒性情況,如果毒性較高,可能是以下原因造成的:
      1.初期細胞接種濃度太低。
      2.轉染復合物加入量過高,因為不同細胞對轉染的敏感度不同。
      3.轉染后6小時需更換培養基,一是lipo2000具有一定毒性,二是培養基需要更換成有血清培養基。其次,轉染后需要對轉染效率進行檢測,比如觀察轉染后細胞熒光情況、qPCR驗證或WB檢測敲減或者過表達蛋白。
      4.對于β-gal表達載體:可用β-gal染色試劑盒進行細胞染色并觀察細胞。轉染效率高的細胞在染色孵育后3-4h即可觀察到,轉染效率低的細胞則需要更長的孵育時間。
      5.對于GFP表達載體:熒光顯微鏡下觀察細胞。如果細胞能在顯微鏡下被觀察到,至少需要有104-105拷貝的GFP蛋白表達,表達太弱的細胞無法鏡檢。GFP表達情況也能使用流式細胞儀進行檢測,同時可加入PI進行染色以監測死細胞情況。
      若是轉染后發現轉染效率不高,可通過以下兩種方法增強轉染效率:
      1.復轉染,即轉染后12-24小時再次進行轉染,前提是該細胞對脂質體的耐受性較好,轉染后細胞死亡數較少;
      2.通過藥篩來殺死未轉入成功的細胞。前提是該質粒帶有抗生素抗性的基因。
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